Телефон:
Главная \ Статьи \ Оценка эффективности применения цинксодержащих препаратов в инъекционной косметологии методом иммунофлуоресцентного анализа.

Оценка эффективности применения цинксодержащих препаратов в инъекционной косметологии методом иммунофлуоресцентного анализа.

« Назад

Оценка эффективности применения цинксодержащих препаратов в инъекционной косметологии методом иммунофлуоресцентного анализа.  10.04.2019 12:00

1 ВВЕДЕНИЕ Цинк – один из наиболее важных из присутствующих в человеческом организме металлов: его количество уступает лишь количеству содержащегося в организме железа. История изучения его биологической роли продолжается уже более 100 лет. Сегодня известны более полутора тысяч цинксодержащих белков, в том числе три сотни ферментов всех классов. Ученые, занимающиеся биоинформатикой, в частности расшифровкой генома человека, отмечают, что 10% наших белков – почти четыре тысячи – содержат цинк. В составе ферментов и факторов транскрипции он вовлечен во все основные происходящие в клетке процессы [10]. На поверхности клетки он регулирует действие кальциевых каналов. Недостаток цинка в организме приводит к дисбалансу механизмов оксидативного стресса и накоплению свободных радикалов [13], что особенно важно для кожных покровов, где сосредоточена почти половина общего количества этого металла. Постепенно проясняется роль цинка в старении. Одна из его функций связана с аутофагией – сложным каскадом катаболических процессов, который клетка использует для обновления своих структур [12]. Вторая функция имеет отношение к процессу постепенного укорочения концов хромосом (теломер). Результаты недавних клинических исследований на пожилых людях указывают, что увеличенное потребление цинка способствует замедлению укорочения теломер [10]. В последние годы появились данные о том, что стабильность теломер как структур ДНК имеет, возможно, большее влияние на гомеостаз клетки, чем ее длина. По данным биохимии комплексы, содержащие двухвалентный цинк, специфично связываются с двумя различными областями теломеры G-квадруплексом (G-quadruplex) [11]. Даже такой неполный перечень функций цинка в организме человека – достаточно весомый аргумент для применения этого незаменимого микроэлемента в антивозрастных программах, например Оценка эффективности применения цинксодержащих препаратов в инъекционной косметологии методом иммунофлуоресцентного анализа В.Хабаров, кандидат химических наук, директор АНО «Научно-исследовательский центр гиалуроновой кислоты»; И.Жукова, врач-дерматовенеролог, кандидат медицинских наук, «Институт красоты на Арбате», И.Кветной, доктор медицинских наук, заведующий отделом патоморфологии НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта Москва, Санкт-Петербург, Россия 2 ЭСТЕТИЧЕСКАЯ МЕДИЦИНА ТОМ XVII • №2 • 2019 НАУЧНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ в качестве компонента биоревитализирующих препаратов. На российском рынке с 2008 года присутствует гиалуронановый гидрогель «Контургель ХПМ», который в ряде модификаций содержит в своем составе ионы двухвалентного цинка. В статье приведены результаты исследования in vivo влияния препаратов гиалуроновой кислоты с добавками цинка на клетки кожи.

Снимок экрана 2019-04-12 в 13.43.16    

Снимок экрана 2019-04-12 в 13.43.25

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Методами иммуногистохимии (иммунофлуорисцентного анализа) изучали динамику экспрессии клетками кожи нейроэндокринных биомаркеров. Объектом исследования служил биологический материал, полученный от 48-летней пациентки в ходе пластической операции круговой подтяжки кожи лица. Экспериментальными материалами – операционные образцы (биоптаты) кожи человека с предварительно введенными препаратами гиалуроновой кислоты («Контургеля ХПМ») (состав препаратов: образец №1 – гиалуроновая кислота 0,8 масс%+хлористый цинк 0,025 масс%; образец №2 – гиалуроновая кислота 0,8–1,0 масс%). Введение «Контургеля ХПМ» осуществляли в ходе стандартного курса биоревитализации – 4-х процедур, выполненных через каждые 14 дней. Кожный лоскут (образец №1) включал многослойный плоский ороговевающий эпителий типичного строения с сохранением всех слоев, очаговой гиперпигментацией базального слоя, очаговым слабо выраженным акантозом (рис. 1). Сосочковый слой дермы относительно широкий гомогенный с единичными меланоцитами. Сетчатый слой широкий, коллагеновые и эластические волокна образуют хорошо развитую сеть. Очаговая местами выраженная перифолликулярная круглоклеточная инфильтрация. Умеренное количество сальных желез. Очаговое застойное полнокровие микроциркуляторного русла. Кожный лоскут (образец №2) включал многослойный плоский ороговевающий эпителий типичного строения с сохранением всех слоев и мелкоочаговой гиперпигментацией базального слоя (рис. 2). Сосочковый слой дермы относительно тонкий, представлен рыхлой волокнистой соединительной тканью. Сетчатый слой широкий, взят до подкожножировой клетчатки. Коллагеновые и эластические волокна формируют сеть. Фибробласты типового строения в умеренном количестве. Небольшое количество потовых желез. Для иммуногистохимического исследования (ИГХ) использовали следующие первичные моноклональные антитела: Ki-67, Collagen I, Collagen III, MMP-9, TGF-b, Klotho, Кальретикулин, p53, АР-1. В качестве негативного контроля проводили иммунофлуоресцентную реакцию без использования первичных антител. Специфичность антител подтверждали в контрольных экспериментах. Оценку иммунофлюоресцентной реакции проводили на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе Olympus FlueView1000 (Olympus, Япония) с использованием программы Morphology 5.0. (Видеотест, Россия). В каждом случае анализировали 5 полей зрения при увеличении 400Х. Определяли относительную площадь экспрессии (в %), рассчитывая ее как отношение площади, занимаемой иммунопозитивными клетками, к общей площади клеток в поле зрения как для маркеров с цитоплазматическим, так и с ядерным окрашиванием. Рис. 1. Образец №1, микробиоптат кожи человека. Окраска гематоксилином и эозином ЭСТЕТИЧЕСКАЯ МЕДИЦИНА ТОМ XVII • №2 • 2019 3 НАУЧНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Статистическая обработка результатов Статистическую обработку результатов проводили в программах Excel 2007, Microsoft Office и аналитической программе Statistica 13.3. Статистическая обработка всех экспериментальных данных включала подсчет среднего арифметического, стандартного отклонения и доверительного интервала для каждой выборки. Для анализа вида распределения использовали критерий Шапиро–Уилка (W-test). Для проверки статистической однородности нескольких выборок были использованы непараметрические процедуры однофакторного дисперсионного анализа (критерий Крускалла–Уоллиса). Для выборок, где разброс был значительным, применяли процедуры множественных сравнений с помощью критерия Манна–Уитни. Для групп с незначительным разбросом применяли t-критерий Стьюдента. Критический уровень достоверности нулевой гипотезы (об отсутствии различий) принимали равным 0,01.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ На рисунке 3 представлены экспериментальные результаты сравнения относительной площади экспрессии различных биомаркеров в изучаемых образцах. Фактически, полученная информация отражает скорость накопления тех или иных белковых молекул в образцах кожи в результате влияния препарата «Контургель ХПМ».

Снимок экрана 2019-04-12 в 13.43.46

Анализ показал, что препараты гиалуроновой кислоты, которые отличались только наличием цинка в одном из образцов (обр. №1), проявили различную биологическую активность по отношению к тем или иным молекулярным маркером, экспрессия которых верифицирована в клетках кожи человека. 4 ОБСУЖДЕНИЕ Ki-67 – негистоновый ядерный белок, играющий важную роль в пролиферации клеток. Было установлено, что Ki-67 экспрессируется в любых активно пролиферирующих клетках и отсутствует в покоящихся клетках, что делает его превосходным маркером для оценки клеточной пролиферации. Точные механизмы действия Ki-67 остаются невыясненными, однако существуют доказательства того, что данный белок связан с синтезом рибосомальной РНК [1, 2]. Довольно невысокие уровни экспрессии белка Кi-67 в образцах свидетельствуют о завершении роста клеточной популяции, особенно это касается образца кожи с введенным гиалуронановым гидрогелем с цинком. Основной компонент дермы – коллагеновые волокна. Они составляют 75% сухой массы кожи. Коллагеновое волокно – это сложноорганизованная структура, которая формируется в результате многостадийного процесса созревания коллагена, начинающегося в фибробластах и заканчивающегося в межклеточном матриксе. В дерме здорового взрослого человека присутствует интерстициальный фибриллярный коллаген, представленный коллагеном I типа (80–90%), преимущественно располагающимся в сетчатом слое дермы, и коллагеном Рис. 3. Сравнение относительных площадей экспрессии маркеров Кi-67, коллаген-I, коллаген-II, ММР-9, TGF-b, Клото, кальретикулин, Р53, АР-1 в образцах кожи №1 (синий) и №2 (красный) 4 ЭСТЕТИЧЕСКАЯ МЕДИЦИНА ТОМ XVII • №2 • 2019 НАУЧНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ III типа (8–12%), сосредоточенным в основном в сосочковом слое. Коллагеновые белки постоянно повреждаются свободными радикалами, реакциями неферментативного гликирования (присоединения остатков глюкозы к амнокислотным остаткам белков), карбамилирования, билирубинирования, протеолиза. Эти изменения приводят к нарушению взаимодействия и ориентации коллагеновых макромолекул. В зонах повреждения активируются металлопротеиназы, которые разрушают неправильно структурированные или ориентированные макромолекулы. Фибробласты реагируют на изменение окружения увеличением или уменьшением синтеза и секреции коллагеновых белков для ремоделирования матрикса. Наиболее значимое влияние цинк оказывает на синтез коллагена III типа и матриксной металлопротеиназы ММР-9 (см. рис. 3). Это можно интерпретировать следующим образом. В связи с тем, что активный синтез коллагена III типа характерен для эмбриональных фибробластов, можно предполагать, что гели гиалуроновой кислоты с цинком увеличивают и/или ускоряют дифференцировку транзиторных стволовых клеток в поврежденных зонах кожи. Увеличение количества новых (возможно юных) фибробластов и миофибробластов с активным геном коллагена III типа приводит к усилению коллагеногенеза и фибриллогенеза. Повышение активности ММР-9 (желатиназы) наблюдается при ремоделировании ткани [Рогова и др., 2011]. Экспериментально доказанный рост активности ММР-9 в коже с признаками хроно- и УФ- старения связан с утилизацией повреждений желатинизированного коллагена и способствует качественному ремоделированию межклеточного матрикса дермы. Таким образом, маркеры коллагена III типа и матриксной металлопротеиназы ММР-9 указывают на сильную (более чем 3,5 раза) стимуляцию ремоделирования дермы препаратами, содержащими в своем составе ионы цинка. Фактор TGF-β – белок, который секретируется большинством клеток организма, включая клетки иммунной системы, и имеет множество функций. В контексте нашего изложения важна его роль в инициации неоколлагеногенеза (то есть, синтеза коллагена de novo). Относительно недавно было установлено, что, активируясь при кожных патологиях, TGF-β индуцирует экспрессию гликолитических генов и способствует усилению гликолитических потоков [Nigdelioglu et al, 2016]. Он также индуцирует активность ферментов PHGDH, PSAT1, PSPH и SHMT2, необходимых для синтеза аминокислот серина и глицина соответственно как исходных материалов для производства коллагена. В образцах кожи с введенным препаратом «Контургель ХПМ», содержащим цинк, экспрессия гена, кодирующего синтез трансформирующего ростового фактора TGF-β, возрастает более чем в 2 раза. Клото – трансмембранный белок, присутствие которого замедляет старение организма [6]. На модели мышей было показано, что искусственно повышенная активность гена белка Клото привела к увеличению продолжительности жизни животных на 20–30% [7]. Внутри клетки белок Клото подавляет активность гена WNT – одного из главных геновтриггеров процесса саморазрушения и истощения клеток [9], что напрямую связано со старением тканей [8]. Большинство работ, описывающих механизмы работы этого белка, посвящено исследованию механизмов подавления различных возрастных патологий нервной, сосудистой и почечной систем [22–25]. Что касается его влияния на старение фибробластов, то в настоящий момент известно, что в ответ на повреждение ДНК Kлото уменьшает клеточное старение в первичных клетках фибробласта человека MRC-5 и эндотелиальных клетках. Потеря активности Клото в первичных клетках фибробластов MRC-5 приводит к развитию фенотипа преждевременного старения, который зависит от белка p53. С возрастом в организме отмечается недостаток белка Клото, что фенотипически проявляется, в частности, атрофией кожи. На сегодняшний день статей, посвященных влиянию этого белка на процессы старения фибробластов, немого. Однако имеющиеся данные свидетельствую о том, что Клото может быть важной терапевтической мишенью, воздействие на которую будет оказывать влияние на процессы старения человеческого организма. По результатам данного исследования количество белка Клото в образцах кожи, содержащих цинксодержащий гидрогель, увеличено в 2,5 раза. Самые высокие уровни экспрессии в исследованных образцах биоптатов кожи были зафиксированы для белка кальретикулина, причем для образца №1 (с цинком) он был увеличен в 1,3 раза. Кальретикулин – маркер эндоплазматического ретикулума (ЭР), многофункциональный кальций-связывающий белок. Кроме регуляции внутриклеточной концентрации кальция, этот белок вместе с кальнексином принимает участие в формировании третичной структуры белков, поскольку обладает функциями шаперона. Кальретикулин связывается с неправильно свернутыми белками и гликопротеинами и предотвращает их транспорт из ЭР к аппарату Гольджи. При участии кальретикулина происходит образование полноценного антигенпрезентирующего макромолекулярного ЭСТЕТИЧЕСКАЯ МЕДИЦИНА ТОМ XVII • №2 • 2019 5 НАУЧНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ комплекса МНС1 [3]. Было показано, что содержание кальретикулина в мозге мышей при их старении постоянно снижается. Снижение с возрастом содержания кальретикулина приводит к снижению контроля качества белка, что вызывает деструктивные изменения в процессе старения [4]. Кальретикулин, локализованный вне ЭР, также выполняет многочисленные функции. Он участвует в процессах миграции, фагоцитоза и фиброгенеза. Местное применение кальретикулина улучшает заживление кожных ран на животных моделях. В ранах, обработанных кальретикулином, увеличивается скорость эпителизации мигрирующими кератиноцитами и наблюдается сильная индукция грануляционной ткани (неодермиса), синтезируемой фибробластами. Нанесение кальретикулина на рану способствует миграции моноцитов и макрофагов к месту поражения, стимулирует экспрессию интегринов (рецепторов фибронектина) на кератиноцитах и фибробластах. В быстро делящихся (пролиферирующих) клетках обнаруживается увеличение концентрации белка р53, что говорит о подготовке клетки для быстрой реакции на возможное возникновение повреждений ДНК. В условиях стимуляции пролиферативной активности фибробластов, например при инъекционном введении препаратов, для остановки клеточного цикла требуется более высокая концентрация белка р53. Активированный белок р53 супрессирует транскрипцию ряда генов. Гены, транскрипцию которых стимулирует р53, кодируют белковые компоненты апоптотической программы и белки, которые регулируют клеточный цикл. Установлено, что активация р53 происходит, в частности, в результате нарушения клеточной адгезии и фокальных контактов в системе «межклеточный матрикс – клетка» [14]. Действуя сразу по нескольким механизмам, р53 осуществляет как быструю реакцию на сильные стрессы, так и регуляцию программы апоптоза поврежденных клеток. Это предотвращает накопление мутаций в клеточной популяции и обеспечивает генетическую стабильность. Кроме того, белок p53 служит важным маркером старения [5]. Из результатов настоящего исследования следует, что «Контургель-ХПМ» с ионами двухвалентного цинка более чем в 2 раза увеличивает экспрессию генов, кодирующих синтез белка р53. Изменения в популяции фибробластов дермы, снижение их пролиферативной и биопродуцирующей активности закономерно приводят к уменьшению количественного и качественного состава межклеточного матрикса дермы. Прежде всего эти изменения затрагивают основной структурный белок дермы коллаген. Нарушение гомеостаза коллагенового матрикса – отличительная характеристика стареющей кожи. В основе этих изменений лежит молекулярный механизм активации в фибробластах транскрипционного фактора АР-1 (транскрипционного комплекса, включающего белки семейств c-fos- и c-jun-) – центрального индуктора нарушения гомеостаза коллагена в коже, представляющего собой ключевое звено в патогенезе старения [15]. Фактор АР-1 регулирует экспрессию генов, кодирующих специфические ферменты – матриксдеградирующие металлопротеиназы ММР-1 и ММР-3. АР-1 индуцирует повышение их экспрессии [16] и как следствие стимулирует деградацию (фрагментацию) матриксных фибрилл коллагена дермы [17]. Активация АР-1 сопровождается одновременным снижением синтеза проколлагенов I и III типа (за счет блокировки эффектов трансформирующего фактора роста TGF-β, способствующего биосинтезу коллагена) [15], а также снижением экспрессии TGF-β Smad-сигнального пути и его мишени – соединительнотканного фактора роста CTGF/CCN2, представляющего собой физиологический регулятор экспрессии коллагена. Известно, что образование АР-1, индуцированное фотостарением, приводит к уменьшению синтеза коллагена путем блокирования передачи сигналов TGF-β-типа II / Smad [18]. В одном из последних по времени исследований корейских ученых [19] было установлено, что некоторые гликозаминогликаны вызывают снижение активности комплекса АР-1 в клеточной культуре человеческих фибробластов. Также вышел ряд работ, посвященных полезной роли травяных экстрактов в замедлении процессов старения. Действие таких экстрактов базируется на блокировании пути MAPK и ингибировании комплекса AP-1 при нормализации пути TGF-β [20, 21]. Обнаруженное в настоящем исследовании 2-кратное снижение количества транскрипционного фактора АР-1, связанное с наличием цинка в образцах кожи, – яркое свидетельство участия этого микроэлемента в замедлении процессов старения. 5 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Следует признать, что доказательная база эффективности применения различных гидрогелевых материалов на основе гиалуроновой кислоты при биоревитализации кожи практически отсутствует, особенно это относится к экспериментам in vivo. В научной и научно-практической литературе можно 6 ЭСТЕТИЧЕСКАЯ МЕДИЦИНА ТОМ XVII • №2 • 2019 НАУЧНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ встретить лишь единичные работы в данной области. Поэтому наше исследование, основанное на результатах иммуногистохимического анализа с использованием 10 иммуноэндокринных маркеров представляет несомненный интерес. Большинство из изученных белковых структур самым непосредственным образом связаны с процессами старения, и поэтому влияние различных соединений на экспрессию генов, кодирующих синтез этих белков, позволит определить механизмы такого влияния. Незаменимый для кожи микроэлемент цинк в составе гиалуронанового гидрогеля «Контургель ХПМ» продемонстрировал значительное влияние на синтез важнейших для кожи белковых макромолекул. Предложенная авторами интерпретация полученных результатов основана на исследованиях в области молекулярной клеточной биологии, биоинформатики, иммуногистохимии.

 

ЛИТЕРАТУРА 1. Sharif R, Thomas P, Zalewski P, et al. Zinc supplementation influences genomic stability biomarkers, antioxidant activity, and zinc transporter genes in an elderly Australian population with low zinc status. Mol Nutr Food Res, 2015;59(6):1200–12. 2. Хабаров ВН. Гиалуроновая кислота в инъекционной косметологии. – М.: Гэотар-Мед, 2017. 3. Ishikura S, Iwaihara Y, Tanaka Y, et al. The Nuclear ZincFinger Protein Zfat Maintains FoxO1 Protein Levels in Peripheral T Cells by Regulating Activities of Autophagy and Akt-Signaling Pathway. J Biol Chem, 2016 May 20, pii: jbc.M116.723734. 4. Siters KE, Fountain MA, Morrow JR. Selective binding of Zn2+ complexes to human telomeric G-quadruplex DNA. Inorg Chem, 2014;53(21):11540–51. 5. Schonk DM, Kuijpers HJ, van Drunen E, van Dalen CH, et al. Assignment of the gene(s) involved in the expression of the proliferation-related Ki-67 antigen to human chromosome 10. Hum Genet, 1989;83(3):297–299. 6. Bullwinkel J, Baron-Lühr B, Lüdemann A, et al. Ki-67 protein is associated with ribosomal RNA transcription in quiescent and proliferating cells. J Cell Physiol, 2006;206(3):624–35. 7. Kuro-o M, Matsumura Y, Aizawa H, et al. Mutation of the mouse klotho gene leads to a syndrome resembling ageing. Nature, 1997;390(6655):45–51. 8. Kurusu H, Yamamoto M, Clark JD, et al. Suppression of aging in mice by hormone Klotho. Science. 2005;309(5742):1829–33. 9. Li Y, He X, Olauson H, et al. FGF23 affects the lineage fate determination of mesenchymal stem cells. Calcif Tissue Int, 2013;93(6):556–64. 10. Bian A, Neyra JA, Zhan M, et al. Klotho, stem cells, and aging. Clin Interv Aging, 2015;10:1233–43. 11. Koyama D, Sato Y, Aizawa M, et al. Soluble Klotho as a candidate for the biomarker of aging. Biochem Biophys Res Commun, 2015;467(4):1019–25. 12. Kim JH, Hwang KH, Park KS, et al. Biological Role of Anti-aging Protein Klotho. Send to J Lifestyle Med, 2015;5(1):1–6. 13. Dalton GD, Xie J, An SW, et al. New Insights into the Mechanism of Action of Soluble Klotho. Front Endocrinol (Lausanne), 2017;8:323. 14. Sopjani M, Rinnerthaler M, Kruja J, et al. Intracellular signaling of the aging suppressor protein Klotho. Curr Mol Med, 2015;15(1):27–37. 15. Ольховский ИА, Горбенко АС, Столяр МА и др. Определение мутации в гене кальретикулина у пациентов с подозрением на хронические миелопролиферативные неоплазии. Гематол трансфузиол, 2014;59(3):12–15. 16. Yang S, Liu T, Li S, et al. Comparative proteomic analysis of brains of naturally aging mice. Neuroscience, 2008;154(3):1107–20. 17. Хабаров ВН. Коллаген в косметической дерматологии. – М.: Гэотар-Мед, 2018. 18. Смирнова ИО, Кветной ИМ, Князькин ИВ и др. Нейроиммуноэндокринология кожи и молекулярные маркеры ее старения. – СПб.: ДЕАН, 2005. 19. Fisher G, Kang S, Varani J. Mechanism of photoaging and chronological skin aging. Arch Dermatol, 2002;138:1462–67. 20. Stephens P, Genever P. Non-epithelial oral mucosal progenitor cell populations. Oral Diseases, 2007;13:1–10. 21. Kohl E, Steinbauer J, Landthaler M, et al. Skin ageing. J Eur Acad Dermatol Venereol (JEADV), 2011;25(8):873–884. 22. Hwang KA, Yi BR, Choi KC. Molecular mechanisms and in vivo mouse models of skin aging associated with dermal matrix alterations. Send to Lab Anim Res, 2011; 27(1):1–8. 23. Na J, Bak DH, Im SI, et al. Anti-apoptotic effects of glycosaminoglycans via inhibition of ERK/AP-1 signaling in TNF-α-stimulated human dermal fibroblasts. Int J Mol Med, 2018;41(5):3090–3098. 24. Gao W, Wang YS, Hwang E, et al. Rubusidaeus L. (red raspberry) blocks UVB-induced MMP production and promotes type I procollagen synthesis via inhibition of MAPK/AP-1, NF-κβ and stimulation of TGF-β/Smad, Nrf2 in normal human dermal fibroblasts. J Photochem Photobiol B, 2018;185:241–253. 25. Zhang M, Hwang E, Lin P, et al. Prunella vulgaris L. Exerts a Protective Effect Against Extrinsic Aging Through NF-κB, MAPKs, AP-1, and TGF-β/Smad Signaling Pathways in UVB-Aged Normal Human Dermal Fibroblasts. Rejuvenation Res, 2018;21(4):313–322.



Напишите нам
Контакты
Заказ по телефону с 9:00 до 19:00
Найти нас легко:
121165 г. Москва, м. Кутузовская, Кутузовский проспект, д. 30/32